가. 감작 혈구 부유액과 대조혈구 부유액의 조제

시험시작 60분 전에 건조감작혈구 (1번병), 건조대조혈구 (2번병) 및 건조흡수혈구 (3번병)를 혈구희석액 (4번병)으로 아래와 같이 용해하여 충분히 흔들어 준다.

나. 검체의 처리

검체는 혈청을 사용한다. 단, 검체에 적혈구나 고형성분등이 함유되어 있을 때는 원심분리하여 고형성분을 완전히 제거한 후 사용하여야 하고, 미생물이 심하게 오염된 검체는사용하지 말아야한다. 또한, 혈청분리후 1주일 이상 보관 필요시에는 -20℃ 이하에 보관하며, 1주일이내에 사용할 경우에는 2 - 8 ℃에 보관한다.

가. 조제된 시약의 보관조건 및 보존기간

나. 개봉된 시약의 보관조건 및 보존기간

가. 정량시험방법

1) 본 시험은 96 well의 가로줄 1-12, 세로줄 A-H로 표시된 Microplate를 사용한다.

2) 첨부된 Dropper로 검체희석액 (5번병)을 1열의 well (1A-1C)에는 4방울 (100ul), 2열 well(2A-2C), 3열 well (3A-3C) 및 4열 well(4A-4C)에는 각각 1방울 (25ul)씩 떨어뜨린다.

검체수에 따라 필요한 만큼을 다른 well (D-H행)을 사용하여 위와 동일한 요령으로 준비한다.

3) Micropipet을 이용하여 양성대조액 (6번병)은 1A well에, 검체희석액 (5번병)은 1B well에 검체는 1C well에 각각 10ul 씩 넣는다. 단, 검체희석액을 음성대조액으로 한다.

4) Micropipet을 25ul로 조절한 후 1열의 내용물을 잘 섞은 다음 1열 well의 혼합된 액 25ul를 취하여 2열 well에 넣고 잘 희석한다.

5) 다시 2열 well의 용액 25ul를 취하여 4)와 동일한 방법으로 3열, 4열 well도 희석한 후 4열 well에서 25ul를 취하여 제거한다.

6) 첨부된 Dropper로 3열 well에는 용해된 대조혈구액 (2번병)을 4열 well에는 용해된 감작혈구액 (1번병)을 각각 1방울 (25ul)씩 넣는다.

(대조혈구와 감작혈구는 떨어뜨리기 전에 충분히 잘 흔들어서 사용하여야 하며, Dropper는 검체희석액용, 대조혈구용, 감작혈구용으로 각각 구분하여 사용하고 혼용하여 사용하지 말아야 한다.)

7) Plate를 Microplate Mixer로 20초간 교반시켜 혈청희석액과 혈구액이 충분히 혼합되도록 한다. 이때 well의 내용물이 서로 혼입되거나 튀지 않도록 주의 한다.

8) Plate를 실온에서 2시간 정치시킨후 응집상을 관찰하여 판정하며, 판정하기 어려운검체는 16시간 이상 정치한 후 최종 판정한다. 이때 Plate는 윗부분을 덮어두어 수분증발을 방지하며 충격을 가하지 않는다.

나. 정성시험방법

1) 본 시험은 96 well의 가로줄 1-12, 세로줄 A-H로 표시된 Microplate를 사용한다.

2) 첨부된 Dropper로 검체희석액 (5번병)을 1열의 well (1A-1B)에는 4방울 (100ul), 2열 well부터 12열 well(2A-2B, 3A-3B, ---, 12A-12B)에는 각각 1방울 (25ul)씩 떨어뜨린다. 검체수에 따라 필요한 만큼을 다른 well (C-H행)을 사용하여 위와 동일한 요령

으로 준비한다.

3) Micropipet을 이용하여 1A well에 양성대조액 (6번병) 10ul를 넣고, 1B well에는 검체를 10ul 넣는다.

4) Micropipet을 25ul로 조절한 후 1열의 내용물을 잘 섞은 다음 1열 well의 혼합된 액25ul를 취하여 2열 well에 넣고 잘 희석한다.

5) 다시 2열 well의 용액 25 ul를 취하여 4)와 동일한 방법으로 12열 well 까지 희석한다음 12열 well의 용액 25ul를 취하여 제거한다.

6) 첨부된 Dropper로 3열 well에는 용해된 대조혈구액 (2번병)을 4열 well에는 용해된감작혈구액 (1번병)을 각각 1방울 (25ul)씩 넣는다.

7) 이하의 조작은 정성시험법과 동일하게 실시한다.

음성대조액(검체희석액)(5번병)은 대조 및 감작혈구에서 응집이 일어나지 않고 양성대조액(6번병)은 감작혈구에서만 응집이 일어나면 실험이 잘된 것으로 인정한다.

음성과 양성의 판정은 아래에 예시된 판정기준에 따라 3열 well과 4열 well의 바닥에서의 혈구응집상을 관찰한 후 판정한다.

* 응집가 판독 및 판정법

가. 정성시험

1) 대조혈구가 적하된 3열 well이 음성으로 판정되고 감작혈구가 적하된 4열 well이

음성으로 판정되면 음성으로 최종판정한다.

2) 대조혈구가 적하된 3열 well이 음성으로 판정되고 감작혈구가 적하된 4열 well이

양성으로 판정되면 양성으로 최종판정한다.

3) 대조혈구가 적하된 3열 well이 양성으로 판정되고 감작혈구가 적하된 4열 well이

양성으로 판정되면 흡수조작후 다시 검사한다.

4) 대조혈구가 적하된 3열 well이 양성으로 판정되고 감작혈구가 적하된 4열 well이음성으로 판정되면 음성으로 최종판정한다.

나. 정량시험

응집판정 방법은 정성시험과 동일한 방법으로 판정하며 양성으로 판정되는 최종희석배율을 항체가로 한다.

1) 용해된 흡수혈구액 (3번병) 200ul를 시험관에 넣고 2500rpm에서 5분간 원심분리하여 상청액을 완전히 제거한다.

2) 검체희석액 (5번병) 200ul 및 검체 10ul를 혈구침전이 있는 시험관에 넣고 잘 혼합한다.

3) 상기 용액을 완전히 혼합하여 혈구침전물을 부유시킨후 실온에서 30분간 정치시킨다.( 단, 10분 간격으로 잘 흔들어 준다. )

4) 2500rpm에서 5분간 원심분리한다.

5) 1A well, 2A well에 검체희석액 (5번병)을 각각 25ul씩 넣고 1A well에는흡수 조작된 4)의 원심 상청액 25ul를 넣는다.

6) Micropipet으로 1A well의 용액을 잘 섞은 다음 25ul를 취하여 2A well넣고 잘 희석한다음 25ul를 버린다.

7) 1A well에는 용해된 대조혈구액(2번병)을, 2A well에는 용해된 감작혈구액 (1번병)을 각각 1방울 (25ul)씩 떨어뜨린다.

8) 이하 조작은 정성시험법에 준하여 실시한다.

* 혈청희석배율

<정량검사시>

<정성검사시>